| （一）酶标抗体的条件
1．纯度高、含杂卵白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。
2．特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只要一条沉淀线,与IgG的全血清也只要一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3．效价高 一样平常琼脂分散判定为1︰64以上才算及格。
（二）酶标志办法
1．交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，使用戊二醛分子上对称的两个醛基，辨别与酶和卵白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键联合而举行标志。标志时应只管即便接纳奇怪纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一同参加举行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶联合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶卵白分子氨基数多得多，后果天生的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而形成酶标物的活性小。一步法操纵：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中徐徐搅拌，只管即便制止气泡发生，完全消融后，徐徐滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的终极浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充实透析或以SephadexG25柱撤除过量的戊二醛，4℃保管备用(也可保管于50%甘油中置高温冰箱)；②抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,迟缓搅拌下参加1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充实透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保管于高温冰箱，制止重复冻融。或冷冻枯燥保管。
⑵ 二步法：是先使酶与戊二醛反响,撤除未反响的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基联合，最初参加大批的赖氨酸关闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操纵：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温安排18h，充实透析或以SephadexG25柱撤除未反响的戊二醛。加心理盐水至1ml然后参加1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混淆后4℃冰箱安排24h，参加0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充实透析，离心去沉淀，上清液即为酶联合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后使用。AKP一样平常不接纳二步法,而只用一步法。
改进HRP二步标志法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，参加25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后参加酷寒的剖析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管颠倒，使乙醇充实流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液消融，参加0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内留宿后，加KH2 PO4，使近中性即可使用。
2．氧化法 接纳过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖局部(与酶活性有关的局部)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基联合,构成酶标抗体。
（1）氧化法操纵历程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混淆后，再参加1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中安排1h，使氧化反响中断，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP－醛基溶液中，参加5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h~3h，参加5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱安排3h或留宿，然后用PBS液充实透析，离心去沉淀物。上清液即为酶联合物，纯化后利用。
（2）改进过碘酸钠法：①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，参加新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min；② 取出后参加0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温安排30min；③参加含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液徐徐搅拌透析6h(或留宿)，使之联合；④参加NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；⑤在以上溶液中迟缓参加等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液消融，装入透析袋，以异样液体在4℃透析除盐留宿；⑥越日取出离心，以撤除不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)联合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；⑦效价测定及格后，参加等量优质甘油，分装小瓶，高温保管。
表 戊二醛法与过碘酸钠法比力
比力项目
|
戊二醛法 |
过碘酸钠法
|
| 一步法 |
二步法 |
| 标志办法 |
复杂 |
较庞大 |
较庞大 |
| 酶使用率 |
2～4% |
2～4% |
70%酶偶联到99%抗体上 |
| 产率 |
＜5% |
＜5% |
＞50% |
| 标志抗体分子量 |
750万 |
＜25万 |
＞40万 |
| 穿入构造才能 |
差 |
好 |
一样平常 |
| 抗体活性丧失 |
多 |
少 |
较多 |
| 酶活性丧失 |
多 |
少 |
较多 |
| 染色效应 |
差 |
较好 |
较好 |
3．二马来酰亚胺法 二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与卵白质半胱氨酸的硫基反响。起首用α－巯基乙胺复原卵白质(IgG),并用N、N‘－Ｏ－苯二马来酰亚胺活化，然后撤除多余的试剂，最初使含二马来酰IgG与含硫基的β－半乳糖苷酶毗连。详细操纵如下：将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对统一缓冲液透析均衡留宿,离心撤除不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα－巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后稀释使每ml含3.0mg左右的复原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘－O－苯二马来酰亚胺溶液，混淆，于30℃温育20min，过SephadexG25柱，撤除未反响的二马来酰亚胺。搜集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,稀释使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β－半乳糖苷酶，置30℃20min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于4℃置24h~72h，再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脱,搜集酶联合物，加叠氮钠(NaN3)防腐，4℃保管备用。
（一） 酶标抗体联合物的纯化
在酶标志的溶液中，呈现的是种种交联物的混淆物,有酶－抗体、酶－抗体－酶、抗体－抗体、酶－酶，乃至另有游离的酶和抗体。在这两头,除了抗体－酶和酶－抗体－酶外,别的都应该赐与撤除。
1．50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能撤除游离的酶及酶－酶聚合体。而不克不及撤除别的不必要者。但此法对酶标抗体的消耗少。
2．过SephadexG200或Sepharose－6B柱。此法较繁琐,并且对酶标抗体的消耗较大,但提纯的质量好。
（三）酶标抗体的判定
1．酶标抗体的活性判定 一样平常以琼脂分散和免疫电泳举行判定。使酶标抗体和响应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)发生沉淀线,洗濯后于底物溶液中显色,显色后用心理盐水漂洗,沉淀线不褪色,阐明酶和抗体都具有活性。精良的酶标联合物琼脂分散滴度一样平常应在1：16以上。
2．酶联合物的定量测定 包罗酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及联合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42
（1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nm－OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度，抗体与酶－戊二醛联合后OD280nm约增长6%，以是乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg，以是又乘以0.62)。
（2）过碘酸钠法：IgG(mg/ml)=(OD280－OD403×0.30)×0.62
(40 000和160 000辨别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶联合率=联合物中的酶量/标志时参加的酶量×100%。
⑸ 酶标志率：OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体－酶卵白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表现HRP在AbE中所占的比例，它与E/Ab克分子比值呈高度正相干。
3．酶联合物的质量尺度 纯化的酶联合物的质量尺度应包罗以下几个方面。
（1）酶的催化活性。
（2）免疫学活性。
（3）未联接的游离酶的量。
（4）未联接的原始免疫反响物的量。
（5）每个酶分子所联接的免疫反响物分子数量。
（6）生化性子。
（7）酶标志免疫实验结果。
酶联合物的质量差别,可惹起实验敏感度的很大变革。比方用差别的步伐制得的HRP－IgG联合物举行酶标志免疫实验，可失掉差别的实验后果，故应予器重。
表 用于ELISA酶标抗体的各项目标参数
| 评价 |
最好 |
好 |
一样平常 |
| 酶联合量(mg/ml) |
≥1.0 |
≥0.5 |
0.4 |
| 酶联合率(%) |
＞30 |
9～10 |
7 |
| 酶IgG克分子比 |
＞1.5 |
1.0 |
0.7 |
（五）酶标抗体的保管
分装小瓶，冻干高温保管。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保管。加甘油或牛血明净卵白(最初浓度为33%)保管更好。制止重复冻融。保管期：一样平常1～2年活性稳定。 |
